黃酮類化合物(Flavonoids)以其廣泛的藥理作用倍受青睞,而中藥材中總黃酮的含量測定成為近年來研究黃酮化合物所關注的焦點。中藥總黃酮的含量測定一般采用比色法、高效液相色譜法等。比色法是被5中國藥典6所采用的最常見的總黃酮測定方法,其中又以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法常用,在堿性條件下,利用其與黃酮物質(zhì)生成紅色鋁螯合物為特征,以蘆丁為對照,在510nm處測定吸光度,從而得到待測物質(zhì)總黃酮的含量,但是研究發(fā)現(xiàn)具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)在蘆丁顯色的最大波長處(510nm左右)也有較強吸收,而黃酮類成分黃芩素、山柰酚在此波長處沒有吸收,從而說明采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,以蘆丁作為對照,不能排除非黃酮類物質(zhì)的干擾,這種方法測定中藥總黃酮含量的專屬性不強。因此,本實驗采用另一種常用的比色法:三氯化鋁比色法,對幾類典型結構的黃酮類化合物(蘆丁、兒茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金絲桃苷、橙皮苷)及多酚類化合物(2,3-二羥基苯甲酸,綠原酸,和厚樸酚,阿魏酸)三氯化鋁顯色前后的吸收峰(200~600nm)進行比較,分析以蘆丁為對照品的三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮的合理性,并對蘆丁顯色的pH值,三氯化鋁濃度、顯色溫度等條件進行優(yōu)化研究。

研究結果表明：

葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入三氯化鋁，反應前后紫外吸收峰的位置沒有發(fā)生改變，而其余物質(zhì)的紫外吸收峰均發(fā)生紅移。從結構上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在5位羥基，不存在鄰二酚羥基和3位羥基，由此可見三氯化鋁的顯色反應主要發(fā)生在3位羥基、4位羰基和鄰二酚羥基，只存在5位羥基、4位羰基時黃酮類物質(zhì)與三氯化鋁不發(fā)生反應。

蘆丁與三氯化鋁發(fā)生顯色反應，生成黃色絡合物，在421nm左右有較強吸收。實驗對幾種常見的多酚類化合物紫外光譜圖進行了掃描，結果表明對于含鄰二酚羥基的非黃酮化合物：2，3一二羥基苯甲酸、阿魏酸、和厚樸酚、綠原酸，三氯化鋁顯色前后在421nm左右均沒有吸收峰，消除了非黃酮類化合物對顯色的干擾。

槲皮素為蘆丁的苷元，顯色后在437nm左右有較大吸收，而蘆丁的最大吸收峰在421nm，說明黃酮的苷和苷元的極性相差較大，槲度素3位羥基可能對反應有影響。木犀草素的結構和蘆丁相比，3位沒有羥基，顯色后在414nm有最大吸收，從而進一步說明3住羥基可能對三氯化鋁顯色反應有影響

具有典型結構的常見的黃酮類苷和苷元：金絲桃苷，蘆丁，異鼠李素，山柰奈酚，三氯化鋁顯色前在421nm處無吸收，顯色后均在蘆丁的最大吸收峰421nm左右有較大的吸收。在現(xiàn)今的實驗條件下，對于大多數(shù)黃酮類中藥材而言，多含有黃酮苷，常見的苷在此波長處有較強吸收，而非黃酮類物質(zhì)在此處無吸收。因此以蘆丁作為對照，三氯化鋁比色法可以成為測定中藥總黃酮含量的理想方法。

對于任一絡合反應，溶液的酸堿度會影響金屬離子的水解及存在形式，影響絡合物的組成。當采用鹽酸（氫氧化鈉）調(diào)節(jié)顯色溶液pH值時，因其酸（堿）性較強，破壞絡合物的結構，無法測得中藥總黃酮含量的真實值，而采用NaAc-HAc緩沖鹽溶液時，加入前后蘆丁的吸收峰位置不變，仍在359nm處，所以采用NaAc-HAc緩沖鹽調(diào)節(jié)顯色溶液的pH值。

從方法的可行性考察結果可以看出，以金絲桃苷為樣品，采用2種方法考察回收率，優(yōu)化的方法準確度更高，所以加入O.1mol／L三氯化鋁，pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液，40℃水浴加熱1Omin為三氯化鋁比色法的優(yōu)化顯色條件。