摘 要： 目的探討D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯(lián)合作用對小鼠認(rèn)知能力的影響。方法 選取健康小鼠40只隨機分為AD模型組、正常組, 各20只。對模型組采用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合給藥, 對正常組小鼠相應(yīng)使用同體積生理鹽水給藥。均連續(xù)給藥3個月, 觀察兩組行為學(xué)、抗氧化指標(biāo)和形態(tài)學(xué)染色的差異。結(jié)果 (1) AD模型組的潛伏期、第一次穿越原平臺位置的時間均明顯長于正常組 (P<0.01) , 而在原平臺象限的活動時間, 前者又明顯短于后者 (P<0.01) ; (2) AD模型組超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽過氧化酶 (GSH-Px) 活性明顯降低、低于正常組 (P<0.01) , 而丙二醛 (MDA) 含量明顯升高, 高于正常組 (P<0.01) ; (3) 剛果紅染色, AD模型組海馬CA2區(qū)細(xì)胞外可見多個Aβ斑, 而正常組未見Aβ斑; (4) 改良氨銀染色, AD模型組海馬CA2區(qū)可見錐體細(xì)胞稀少、不整齊, 核周體內(nèi)棕黑色細(xì)絲增粗、局部呈小塊狀, 神經(jīng)元外可見老年斑;而正常組海馬CA2區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰。結(jié)論 通過D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對小鼠的復(fù)合、慢性作用, 部分復(fù)制了AD的病理變化, 是建立AD動物模型比較理想的方法。

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD) , 由德國醫(yī)生Alois Alzheimer于1906年最先描述, 是與年齡高度相關(guān)的、以進行性認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD腦三大病理變化為:神經(jīng)元外由β-淀粉樣蛋白 (amyloidβ-protein, Aβ) 組成的老年斑 (senile plaques, SP) 、神經(jīng)元內(nèi)由異常磷酸化tau蛋白 (p-tau) 組成的神經(jīng)元纖維絲纏結(jié) (neurofibrillary tangles, NFTs) 以及神經(jīng)元及其突觸的廣泛丟失。但其發(fā)病機制尚未完全明了, 亦無根治藥物。關(guān)于AD研究的最大難題是沒有特異性的動物模型, 以致于嚴(yán)重影響研究的針對性和實用性[1]。因而, 探索建立理想的動物模型是目前AD研究最迫切的工作。現(xiàn)有的AD動物模型如老化型、損傷型、轉(zhuǎn)基因型、胰島素抵抗型、腦缺血型等, 均只是在一個局部或一個點反映AD的病理變化和發(fā)病機制, 急需建立AD復(fù)合模型, 來揭示AD發(fā)病機制、提供研究以及指導(dǎo)治療。為此, 本課題探討三氯化鋁和D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合作用對小鼠認(rèn)知能力的影響, 試圖為復(fù)制AD動物復(fù)合模型提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

健康雄性昆明小鼠40只, SPF級, 10月齡, 體質(zhì)量 (40±5) g。由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院實驗動物中心[許可證號:SCXK (鄂) 2016-0008、SYXK (鄂) 2016-0031]提供。實驗前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周, 且剔除行為學(xué)反應(yīng)明顯遲緩者。MT-200水迷宮行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)購于成都泰盟。D-半乳糖 (D-galactose;純度>98%) 、亞硝酸鈉 (Sodium nitrite;純度>98%) 、三氯化鋁 (Aluminium trichloride;純度>98%) 、谷胱甘肽過氧化酶 (Glutathione peroxidase, GSH-Px) 試劑盒、超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 試劑盒、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 試劑盒 (武漢博士德) 。

1.2 分組與給藥

選取健康小鼠40只隨機分為兩個組:AD模型組、正常組, 各20只。對模型組小鼠采用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合給藥: (1) D-半乳糖 (500mg/kg;濃度:10 mg/0.1 mL或100g/L) 、亞硝酸鈉 (45mg/kg;濃度:0.9 mg/0.1 mL或9g/L) , 配成水溶液、頸背部皮下注射; (2) 三氯化鋁 (40 mg/kg) , 按每只小鼠平均飲水5mL/d配制液體, 讓小鼠自由飲用;均持續(xù)用藥3個月。對正常組小鼠相應(yīng)使用同體積生理鹽水給藥。

1.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試

(1) 定位航行實驗。檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶過程和能力。連續(xù)進行5d。每只小鼠一天接受3次訓(xùn)練, 依次從不同象限中點, 頭朝池壁入水, 去尋找平臺, 記錄小鼠找到平臺的潛伏期、搜索策略以及游泳速度。實驗時先讓小鼠放在平臺上適應(yīng)15s。若小鼠在60s內(nèi)未找到平臺, 則計潛伏期為60s。小鼠無論找到平臺與否, 均被安排在平臺上休息15s, 然后才進行下一輪訓(xùn)練。 (2) 空間探索實驗。觀察小鼠的空間記憶保持能力。在定位航行實驗結(jié)束后第1天進行。移去平臺, 讓小鼠自由游泳30s、尋找平臺。記錄每只小鼠第1次穿越原平臺位置的時間以及在每個象限的活動時間。

1.4 取材與染色

水迷宮測試完畢后取材即斷頭取腦: (1) 將小鼠頭靠近枕骨剪斷, 置于事先準(zhǔn)備好的冰盤上, 并用剪刀剔除頭后部的軟組織; (2) 由后向前, 沿中線剪開小鼠頭皮, 并將皮膚、皮下組織向兩側(cè)分離, 暴露顱骨; (3) 同樣沿中線向前, 剪開枕骨、頂骨直至頂、額兩骨分界處, 用鑷子將顱骨由中線向兩側(cè)快速掀開; (4) 輕輕分開腦組織與顱骨, 剪斷與顱骨相連的腦神經(jīng)等, 取出全腦, 在前囟后2.3mm至前囟后6.3mm處分離出大腦皮質(zhì)、海馬, 用生理鹽水清洗, 放入液氮中保存。整個操作在2min之內(nèi)完成。灌注取腦:用10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠, 迅速開胸, 剪開右心耳和心尖部, 灌注針經(jīng)左心室插入升主動脈, 固定灌注針, 用生理鹽水 (含1%肝素) 快速灌注, 直至右心耳流出的液體清亮?xí)r更換0.1mol/L、4℃的固定液快速灌注。快速灌注20s后, 速度調(diào)整為20滴/min, 持續(xù)20min。灌注完畢后, 完整取出腦組織, 置4℃冰箱后固定;備用。常規(guī)做剛果紅染色、改良Bielschowsky氨銀液染色。

1.5 生化檢測

從液氮中取出小鼠大腦皮質(zhì)、海馬, 稱量、剪碎, 按質(zhì)量體積比 (W/V) 1∶9加入4℃生理鹽水, 用電動勻漿機 (3 000r/min) , 制成10%大腦皮質(zhì)、海馬組織勻漿液, 離心15 min, 取上清液分裝在EP管中。嚴(yán)格按各試劑盒說明書操作, 依次測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

在Excel中建立數(shù)據(jù)庫, 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料以百分率 (%) 表示, 兩組間比較選擇卡方 (χ) 檢驗或確切概率檢驗;計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s) 表示, 兩組間比較應(yīng)用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05, P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試結(jié)果

(1) 在定位航行實驗中, 從第3天開始, AD模型組的潛伏期明顯長于正常組, 且它們之間的差距逐漸加大 (P<0.05) 。在4d~5d, AD模型組潛伏期顯著長于正常組 (P<0.01) 。詳見圖1A。 (2) 在空間探索實驗中, 第一次穿越原平臺位置的時間, AD模型組小鼠明顯長于正常組 (P<0.01) , 而在原平臺象限的活動時間, AD模型組小鼠又明顯短于正常組 (P<0.01) 。詳見圖1B、圖1C。

圖1 兩組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試結(jié)果

注:1A為潛伏期:與正常組比較, AD模型組#P<0.01 P<0.01, ##P<0.01;1B為第一次穿越原平臺位置時間:與正常組比較, AD模型組++P<0.01;1C為在原平臺象限活動時間:與正常組比較, AD模型組**P<0.01。

2.2 兩組小鼠SOD、GSH-Px及MDA含量檢測結(jié)果

與正常組對應(yīng)的3個指標(biāo)比較, AD模型組SOD、GSH-Px活性明顯降低, 而MDA含量明顯升高。詳見表1。

表1 兩組SOD、GSH-Px及MDA檢測結(jié)果比較 (±s)

2.3 兩組腦組織Aβ斑的形成情況

剛果紅染色, AD模型組海馬CA2區(qū)細(xì)胞外可見多個Aβ斑, 染成淡紅色, 在其周圍可能有浸潤的膠質(zhì)細(xì)胞及變性神經(jīng)細(xì)胞染成藍色, 背景清晰 (圖2A) ;而正常組錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰, 未見Aβ斑 (圖2B) 。

圖2 兩組小鼠海馬剛果紅染色結(jié)果 (×400, 40個)

注:2A為AD模型組, 2B為正常組

改良Bielschowsky氨銀液染色結(jié)果:AD模型組海馬CA2區(qū)可見錐體細(xì)胞排列不整齊、稀疏、萎縮、核固縮, 核周體內(nèi)棕黑色細(xì)絲增粗、呈小塊狀;軸突內(nèi)神經(jīng)元纖維模糊不清;神經(jīng)元外可見Aβ斑或老年斑, 體積較大、數(shù)量較多, 且周圍有浸潤的膠質(zhì)細(xì)胞及變性的神經(jīng)元 (圖3A) 。正常組海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 可清晰地看到棕黑色的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)即神經(jīng)原纖維, 在核周體內(nèi)交織成網(wǎng), 并伸入樹突和軸突;神經(jīng)元外未見Aβ斑或老年斑 (圖3B) 。詳見圖3。

圖3 兩組小鼠海馬改良Bielschowsky氨銀液染色結(jié)果 (×400, 40個)

注:3A為AD模型組, 3B為正常組。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示, 采用D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對小鼠聯(lián)合、持續(xù)給藥3個月后, 行為學(xué)測試, AD模型組小鼠的潛伏期和第一次穿越原平臺位置時間增長, 而在原平臺象限活動時間縮短。這說明這些小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力和空間記憶保持能力出現(xiàn)明顯的缺損。AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中SOD、GSH-Px活性明顯下降和MDA表達明顯上升。這表明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化 (lipid peroxidation, LPO) 反應(yīng)。SOD、GSH-Px是體內(nèi)十分重要的抗氧化酶, 其濃度和活性的降低, 會產(chǎn)生大量氧自由基 (ROS) 損傷腦組織;而MDA是脂質(zhì)過氧化后的代謝產(chǎn)物, 其濃度高低標(biāo)志著脂質(zhì)過氧化的程度[7]。AD模型組剛果紅染色在神經(jīng)細(xì)胞外可見多個淡紅色的類Aβ斑, 銀染可見海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞丟失、排列紊亂, 神經(jīng)元纖維增粗、局部呈小塊狀。盡管這些表現(xiàn)不十分典型, 但也不同程度地表達AD部分的病理學(xué)特征。

本實驗將三氯化鋁按照每天、每公斤體質(zhì)量40mg放入飲用水中, 讓小鼠自由飲用, 且持續(xù)時間長達3個月, 大大地超過了世界衛(wèi)生組織1 mg的標(biāo)準(zhǔn), 直接造成小鼠鋁的慢性中毒。鋁是一種慢性蓄積性神經(jīng)毒素。三氯化鋁毒性一方面通過損害膜結(jié)構(gòu)、介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化;另一方面引起神經(jīng)元纖維變性、抑制神經(jīng)傳導(dǎo)[11];還可以誘導(dǎo)α-分泌酶和β-分泌酶活性不均衡作用, 導(dǎo)致腦組織β-淀粉樣蛋白的過表達。長時間注射D-半乳糖, 其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能進一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi), 影響滲透壓, 引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化, 導(dǎo)致一系列氧化損傷。亞硝酸鈉的氧化性能將血紅蛋白中的二價鐵氧化成三價鐵, 失去攜帶、輸送氧氣功能, 使機體組織產(chǎn)生缺氧性中毒。

通過D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對小鼠的復(fù)合、慢性作用, 部分復(fù)制AD的病理變化。一是脂質(zhì)過氧化, 產(chǎn)生ROS連鎖反應(yīng), 損傷細(xì)胞膜, 繼而神經(jīng)元變性、壞死;二是可能出現(xiàn)的Aβ斑, 誘導(dǎo)神經(jīng)元過早凋亡;三是可能產(chǎn)生的神經(jīng)元纖維變性, 使神經(jīng)元纖維退化、萎縮, 大腦早老化。這三個發(fā)生、發(fā)展過程單個或聯(lián)合作用, 均能導(dǎo)致小鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元及其之間的突觸丟失, 從而導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能的障礙, 即成功復(fù)制小鼠AD模型。因此認(rèn)為, D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁三者聯(lián)合作用是建立AD動物模型的比較理想的方法。